液氮保存對人主動脈瓣組織細胞活力的影響

　　20世紀60年代初，Ross首次成功地將人同種主動脈瓣原位移植於(yu) 人體(ti) ，經過近40a臨(lin) 床技術和瓣膜保存方法的不斷改進，國內(nei) 外有關(guan) 活性同種異體(ti) 主動脈瓣的研究不斷發展，同種生物瓣的研究和應用取得了很大進步。人同種帶瓣管道具有中心血流、抗鈣化及抗血栓形成且無需術後長期抗凝治療等優(you) 點，從(cong) 而在臨(lin) 床應用上顯示出其他瓣膜無可比擬的優(you) 越性及應用前景。盡管臨(lin) 床上瓣膜的應用曆史比較早，但國內(nei) 外對於(yu) 同種瓣膜的組織活性與(yu) 冷凍保存時間的相關(guan) 性研究尚少見報道。本研究目的在於(yu) 通過對瓣膜組織活性的量化，探討適宜的瓣膜保存期限，為(wei) 臨(lin) 床應用同種異體(ti) 瓣提供可靠的實驗依據。

　　1、材料和方法

　　1.1 材料

　　選用(18～35)歲健康成年男性腦死亡30min內(nei) 取材的主動脈瓣20個(ge) 。供體(ti) 心髒均在腦死亡後30min內(nei) 無菌取出，剪開心髒四腔，4℃生理鹽水衝(chong) 洗3次，用3層無菌塑料袋盛入供心並逐層線紮，冰壺帶回，在無菌台上修剪成帶瓣管道。實驗分為(wei) 新鮮瓣膜對照組(Ⅰ組)和冷凍保存組(Ⅱ～Ⅹ組)。對照組取材後不入液氮內(nei) 保存，瓣葉剪下後直接供實驗用。冷凍保存組依據在液氮((196℃)中保存時間分為(wei) Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ，Ⅶ，Ⅷ，Ⅸ，Ⅹ組，分別為(wei) 冷凍保存1，3，6，9，12，15，18，21，24mo的瓣膜。每組2個(ge) 瓣膜共6個(ge) 瓣葉。

　　1.2 方法

　　修剪備用的帶瓣主動脈管道浸入含低濃度抗生素和二甲基亞(ya) 碸(DMSO)的RPMI1640營養(yang) 液中，3層無菌耐低溫塑料袋分別束紮，外裹錫箔袋，標記時間後，置入4℃冰箱中2h，再置入液氮蒸氣中使瓣膜緩慢降溫，最後放入液氮中長期保存，降溫速率保持在1℃・min-1 左右。定期添加液氮，使瓣膜始終保持在-196℃。實驗當日取保存不同時間的帶瓣管道在37℃水浴箱中快速複溫5min，然後掀去包裹薄膜，再在37℃無菌生理鹽水中快速複溫，複溫中不斷輕柔翻動帶瓣管道，使其各部位的溫度均勻上升。新鮮組瓣膜及冷凍複溫後各組瓣膜均在超淨工作台上無菌取出，剪切瓣葉並觀察其大體(ti) 形態，分切瓣葉並切成1mm×1mm×1mm組織碎塊做以下實驗分析。

　　1.2.1 瓣膜細胞活力測定

　　組織碎塊置入2。5g・L-1 胰蛋白酶溶液在室溫下消化2～3h，200目鋼網過濾，濾液經1500r・min-1 離心10min，去上清液，加入少量營養(yang) 液終止消化，1500r・min -1 離心10min，去上清液，製備成5×106左右的細胞懸液，加入20g・L-1 胎盼藍，滴入血細胞計數器，光鏡下計數四個(ge) 大格內(nei) 的著色細胞和拒染細胞即活細胞，根據下式計算細胞活力：細胞活力=[拒染細胞數/(著色細胞數+拒染細胞數)]×100%

　　1.2.2 組織培養(yang) 觀察

　　各組瓣膜組織碎塊置入25mL培養(yang) 瓶內(nei) ，待組織塊貼壁後，加入少量含100mL・L-1 胎牛血清(FCS)的RPMI1640營養(yang) 液中，在37℃含50mL・L-1 二氧化碳培養(yang) 箱中孵育72h，觀察組織生長情況並追加少量營養(yang) 液。以後每3d更換營養(yang) 液一次，培養(yang) 後3，7，10，14，17，21，24和28d在倒置光相差顯微鏡下觀察並攝像記錄。

　　統計學處理：瓣膜細胞活力測定結果以(x ±s%)表示，用SigmaStat2。0統計軟件包處理，冷凍保存組各組與(yu) 新鮮瓣膜組組間數據行t檢驗，P<0。05為(wei) 有顯著性差異。

　　2、結果

　　2.1 瓣膜細胞活力

　　Ⅰ組瓣膜細胞活力最大，為(wei) 93.85%。Ⅱ～Ⅹ組細胞活力均較Ⅰ組減低(P<0.05)，且隨保存時間加長而逐漸減低;Ⅷ，Ⅸ，Ⅹ各組的細胞活力與(yu) Ⅰ組及Ⅱ～Ⅶ組相比明顯減低(P<0.05，Tab1)。表1 新鮮瓣膜組與(yu) 冷凍保存瓣膜組的細胞活力對比(略)。

　　2.2 組織培養(yang)

　　Ⅰ組組織培養(yang) 1wk時細胞從(cong) 組織塊邊緣開始移行，細胞增殖較快，細胞數目較多，4wk時鏡下細胞占滿培養(yang) 瓶壁;Ⅱ～Ⅶ組瓣膜組織細胞移行較新鮮瓣膜組稍晚，約1～2wk時間，細胞增 殖稍慢，細胞數目仍較多，4wk時鏡下細胞數較多;Ⅷ～Ⅹ組瓣膜組織細胞在2wk後開始移行，細胞增殖較慢，細胞數目較少，4wk時鏡下細胞數較Ⅰ組明顯減少(Fig1～6)。

　　3、討論

　　人同種主動脈瓣具有中心血流、抗鈣化及抗血栓形成且無需術後長期抗凝治療等優(you) 點，從(cong) 而在臨(lin) 床應用上顯示出其他瓣膜無可比擬的優(you) 越性及應用前景。

　　臨(lin) 床資料表明，人活性同種主動脈瓣的耐久性(dura-bility)優(you) 於(yu) 無活性瓣膜。1962年，Ross首先在臨(lin) 床上將人同種主動脈瓣(human aortic valve homo-graft，HAVH)原位置換成功。同年Barratt-Boyes 報道了44例HAVH置換的成功經驗，但這些瓣膜活性喪(sang) 失，瓣膜10a衰壞率較高。

　　1960年代後期，臨(lin) 床采用4℃營養(yang) 液保存的HAVH，其組織細胞在保存液中可存活1wk，瓣膜壽命延長，衰壞率降低。1970年代後期，O’Brien等采用液氮保存的HAVH(cry-opreserved aortic valve homograft，CAVH)，行主動脈置換術192例，發現瓣膜耐久性明顯提高，10a衰壞率為(wei) 零;同時發現CAVH植入宿主體(ti) 內(nei) 9a3mo，經細胞培養(yang) 證明供體(ti) 瓣纖維細胞能在宿主體(ti) 內(nei) 長期存活，並提出纖維細胞存活的同種活細胞瓣膜(viable aortic valve homograft，VAVH)的概念。VAVH具有良好的血流動力學、較強的抗感染、抗血栓作用且無需抗凝治療，它的抗張強度較無活性瓣膜大為(wei) 提高，所有上述功能的優(you) 越性都基於(yu) 瓣膜組織良好的結構完整性，包括纖維細胞功能代謝正常及纖維支架的形態結構較完整等。HAVH的采集、滅菌處理、保存方法等均可影響瓣膜活性和組織代謝。采集時主要考慮二種因素的影響：供體(ti) 的年齡和熱缺血時間(warm ischemia time，WIT)。供體(ti) 選擇健康成年人，年齡多在20～35歲。

　　有資料表明，超過45歲的供體(ti) 臨(lin) 床使用後易發生瓣膜蛻變、鈣化和關(guan) 閉不全。供體(ti) 在心腔冷灌前主要為(wei) 熱缺血損傷(shang) ，隨WIT延長，組織細胞可發生胞質水腫、內(nei) 質網擴張、線粒體(ti) 腫脹等可逆性損傷(shang) ，隨WIT不斷增加，細胞可產(chan) 生線粒體(ti) 絮狀沉積、核膜溶解、核染色質丟(diu) 失、細胞裂解等不可逆性損傷(shang) ，最終導致細胞死亡，因此應盡量縮短WIT。本研究中WIT控製在30min內(nei) ，及時對供體(ti) 心腔用4℃生理鹽水冷灌衝(chong) 洗，盡快清除殘留在心腔及瓣膜上的血塊，有效地降低了瓣膜組織溫度，使瓣膜組織細胞代謝減慢，從(cong) 而減低組織細胞因缺血缺氧產(chan) 生的損傷(shang) 。HAVH采集後應及時進行滅菌處理。瓣膜應用早期，滅菌時使用毒性較大的化學物質或以高能電子射線照射，組織抗張強度差，瓣膜耐久性差，已不再使用。目前瓣膜滅菌普遍采用低濃度抗生素滅菌法，這種方法能較好地保存組織活細胞。我們(men) 采用的HAVH處理和滅菌方法源於(yu) 美國鹽湖城的L.D.S醫院，並把保存液中的小牛血清含量提高5%，經此方法處理和冷凍保存的瓣膜臨(lin) 床應用效果良好。瓣膜在降溫過程中加用適宜濃度的冷凍保護劑(甘油、DMSO等)，可有效地減少冷凍損傷(shang) 。冷凍降、複溫對瓣膜組織結構，特別是內(nei) 皮細胞影響較大。采用快速降溫(10～100℃・min-1 )時，細胞質、細胞核和染色體(ti) 內(nei) 均有冰晶形成，細胞膜結構易於(yu) 破裂;溫度驟降使細胞內(nei) 酶變性導致低溫休克(thermal shock)對細胞的損害作用更甚於(yu) 冰凍的機械作用。本實驗證明，緩慢降溫對組織的破壞較輕，而采用1℃・min-1 降溫效果最佳，這與(yu) 有些報道結果相同。在不同的降溫速率，DMSO對組織細胞的 影響也不同，1℃・min-1 降溫時DMSO的適宜濃度為(wei) 100g・L-1 。複溫常采用37～42℃水溶液中快速複溫，以減少組織過冰點時細胞再結晶的形成。

　　我們(men) 在快速複溫過程中，采用37℃恒溫水浴箱複溫，水溫始終保持於(yu) 37℃左右，並快速解除包裹塑料膜，再在無菌溶液中梯度融解，冷凍保護劑得到及時稀釋，從(cong) 而維持了組織細胞內(nei) 外滲透壓的平衡，組織破壞較輕，並在順梯度濃度稀釋時加用適量營養(yang) 液，從(cong) 而最大可能地保留了瓣膜組織活細胞。瓣膜組織觀察的指標有組織結構、組織活性、細胞增殖能力、代謝功能、細胞特異性抗原鑒定等，其中組織活性和細胞增殖能力是反映瓣膜是否具有活性的兩(liang) 個(ge) 重要指標。活性是指細胞或組織維持自身和與(yu) 外界能進行正常交換的能力，組織活性主要觀測細胞活力，包括內(nei) 皮細胞和纖維細胞的活力;細胞增殖能力則主要觀察組織細胞培養(yang) 後的生長情況。細胞活力測定可定量反映瓣膜組織細胞存活程度。從(cong) 實驗結果可以看出，新鮮瓣膜的細胞活力最高，且細胞增殖能力較高，說明新鮮瓣膜最大限度地保留了組織活細胞，組織結構較完整，細胞增殖活躍。液氮保存的瓣膜組織細胞活力均較新鮮瓣膜顯

　　著減低，說明液氮保存1mo的瓣膜組織細胞即出現損傷(shang) 情況，且其程度與(yu) 瓣膜冷凍保存時間呈正相關(guan) 關(guan) 係，冷凍保存時間愈長，瓣膜組織細胞損傷(shang) 愈重，組織細胞存活率愈低。理論上認為(wei) ，液氮保存時組織代謝接近停止，瓣膜活細胞可長期保存，但瓣膜組織代謝雖處於(yu) 低水平，卻沒有完全停止，細胞仍處於(yu) 緩慢的無氧代謝過程，細胞內(nei) 外可能仍有離子交換及滲透壓的改變，隨保存時間延長，細胞內(nei) 外代謝產(chan) 物不斷積累，以及冷凍降溫過程中各種物質濃度積累到有害程度，可導致細胞完整性的破壞，從(cong) 而使細胞受到損傷(shang) 。液氮保存1～15mo瓣膜組織活細胞在60%以上，組織培養(yang) 後的細胞生長情況較好，證明液氮保存1～15mo的瓣膜組織保留大部分的組織活細胞，且細胞增殖能力仍在較高水平，瓣膜組織活性較高。而液氮保存18～24mo瓣膜組織活細胞在50%或以下，且細胞增殖能力較差，雖然保留了部分組織活細胞，但從(cong) 整體(ti) 上看，瓣膜組織活性較低，因此臨(lin) 床應用價(jia) 值較小。

　　綜上所述，液氮保存可影響瓣膜的組織代謝和活性，其程度隨保存時間延長而逐漸加重。結合形態學及相關(guan) 資料可以認為(wei) ，液氮保存1～15mo瓣膜組織活性仍較高，瓣膜組織代謝相對處於(yu) 較高水平，臨(lin) 床應用價(jia) 值較大;而液氮保存18～24mo瓣膜組織活性明顯減低，瓣膜組織代謝相對處於(yu) 較低水平，瓣膜活性較差，其臨(lin) 床耐久性可能減小。因此可認為(wei) ，人同種主動脈瓣膜保存期限以15mo以內(nei) 為(wei) 宜。