不同複溫方法對液氮保存人同種瓣活性影響的實驗研究

目的：尋找一種能最大程度保持液氮貯存人同種主動脈瓣活性的複溫方法。自增壓液氮罐
方法：同種主動脈瓣(n=36)隨機分為(wei) 6組，Ⅰ組為(wei) 新鮮同種主動脈瓣，Ⅱ～Ⅵ組經液氮保存3月後，分別采用①42℃水浴複溫(Ⅱ組)，②(1.0±0.2)℃/min(Ⅲ組)，③(4.0±0.5)℃/min(Ⅳ組)，④(10.0±2.0)℃/min(Ⅴ組)；⑤(30.0±4.5)℃/min(Ⅵ組)。將同種主動脈瓣複溫至4℃，對所有同種主動脈瓣進行台盼藍染色活細胞計數、24小時葡萄糖代謝率測定，氚化胸腺嘧啶脫氧核苷(3H-TdR)參入、瓣膜組織培養(yang) 。
結果：上述指標Ⅰ組顯著優(you) 於(yu) 其餘(yu) 各組(P＜0.05)，Ⅳ組優(you) 於(yu) Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ組(P＜0.05)。組織培養(yang) Ⅰ組細胞生長優(you) 於(yu) 其餘(yu) 各組，且早於(yu) 各組3～4天。
結論：不同複溫方法對同種主動脈瓣活性影響不同，以4℃/min勻速複溫法對同種主動脈瓣活性影響最輕。

關(guan) 鍵詞：同種 主動脈瓣 活性

　　我們(men) 通過本研究觀察不同複溫方法對同種瓣活性的影響，旨在尋找一種能較好保持同種瓣活性的複溫方法，為(wei) 臨(lin) 床合理應用同種瓣提供依據，現報道如下。

材料與(yu) 方法
　　1.取材分組　於(yu) 1995年10月～1996年5月選擇46例健康成人腦死亡者，於(yu) 死亡30分鍾內(nei) ，在無菌條件下取出心髒，隨機抽取36例(年齡20歲～32歲，平均26歲)分為(wei) 6組(n=36)。4℃生理鹽水
衝(chong) 洗、修剪，保留主動脈瓣，插入銅-康銅熱電偶測量電極，將同種瓣置入含萬(wan) 古黴素(50mg/L)、二性黴素(25mg/L)的RPMI1640液，經4℃過渡2小時後移入液氮氣相中放置2小時，然後置入液氮中，保存3月後取出，分別以①42℃水浴複溫(Ⅱ組)；②(1.0±0.2)℃/min(Ⅲ組)；③(4.0±0.5)℃/min(Ⅳ組)；④(10.0±2.0)/min(Ⅴ組)；⑤(30.0±4.5)℃/min(Ⅵ組)的速率將同種瓣複溫至4℃，新鮮未冷凍同種瓣對照(Ⅰ組)。
　　2.溫度測量控製裝置與(yu) 方法　根據升降式降溫儀(yi) 原理，自製複溫裝置，如圖1所示。

圖1　升降式溫度測量控製裝置
1　液氮容器　2　銅-康銅熱電偶
3　同種瓣保存袋　4　液氮　5　旋轉升降器　6　冰瓶
7　植物油　8　標準探極　9　冰水　10　數字式萬(wan) 用電表

　　3.測量探極置於(yu) 同種瓣葉內(nei) ，標準探極插入冰水瓶，測量兩(liang) 探極之間電勢差，依公式與(yu) 攝氏溫度換算。根據複溫速度要求，將含有同種瓣材料的托盤，通過細繩由旋轉升降器牽引上升，利用萬(wan) 用電表顯示電勢差，控製升降速率。換算公式：U=0.0385t+0.00004t2-5.4295×10-8t3，其中U為(wei) 電勢差值(單位：mV)，t為(wei) 攝氏溫度值(單位：℃)。
　　4.實驗方法　①台盼藍染色法：0.25%胰酶消化剪碎的主動脈瓣葉，270目纖維濾膜過濾，濾液1200轉/分離心15分鍾，棄上清液，按1∶1將5%台盼藍加入細胞懸液，光學顯微鏡計數。②葡萄糖代謝率測定：每10mg瓣膜組織中加入RPMI1640液1ml，在37℃、5%CO2孵箱中孵育24小時後用自動生化分析儀(yi) 作葡萄糖定量測定。代謝率［mmol/(mg．24h)］其中RPMI1640液原液同條件下葡萄糖定量為(wei) 11.3mmol/L。③氚化胸腺嘧啶脫氧核苷(3H-TdR)參入量：瓣葉組織在孵育中加入3H-TdR 2μci，24小時後取出瓣葉，經漂洗後加入2mol/L NaOH，加熱將其溶解，加入閃爍液10ml，用自動液閃計數儀(yi) 計數(CPM)。3H-TdR參入量［CMP/(mg．24h)］=，其中RPMI1640原液本底為(wei) 27CPM。④組織培養(yang) ：以組織塊貼壁方法在37℃、5%CO2孵箱中RPMI1640培養(yang) 液培養(yang) ，每周換液2次，每次半量，待組織塊周邊有細胞長出後，拍照。
　　5.統計學方法　台盼藍染色活細胞百分率行組間χ2檢驗，葡萄糖代謝率及3H-TdR參入量以Image12.gif (851 bytes)±s表示，行組間t檢驗，P＜0.05差異有顯著意義(yi) 。

結　果
　　台盼藍拒染細胞百分率、葡萄糖代謝率及3H-TdR參入量結果見表1。表1顯示：Ⅱ～Ⅵ組活細胞百分率(主要為(wei) 內(nei) 皮細胞)顯著低於(yu) Ⅰ組(P＜0.05)；而Ⅳ組又顯著高於(yu) Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ組(P＜0.05)；Ⅰ組葡萄糖代謝率、3H-TdR參入量顯著高於(yu) 其它各組(P＜0.05)，Ⅳ組又顯著高於(yu) Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ組(P＜0.05)。組織培養(yang) Ⅰ組細胞生長優(you) 於(yu) 其餘(yu) 各組，且早3～4天。Ⅱ～Ⅵ組培養(yang) ，Ⅳ組細胞生長優(you) 於(yu) Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ組。

討　論
　　同種瓣形態結構的完整決(jue) 定著其耐久性。瓣膜冷凍保存不同於(yu) 單細胞，由於(yu) 細胞成分多樣，細胞間質存在，在複溫過程中，使熱量交換不均勻，外周組織內(nei) 冰晶融化可從(cong) 內(nei) 部吸收熱量，使內(nei) 部組織再結晶加重，可造成細胞嚴(yan) 重的機械性損傷(shang) 。另外，低溫蛋白質的變性，脂質的丟(diu) 失，細胞膜通透性的改變以及細胞膜上小孔的形成，使水分子易通過細胞膜，引起細胞內(nei) 水負荷加重，超過一定時間或程度時，細胞便會(hui) 破裂。本研究結果發現，不同複溫速率對液氮保存的同種瓣均有損害。臨(lin) 床上常用的42℃水浴複溫法，其複溫速率不均勻，細胞損害重，活性低，可能與(yu) 細胞再結晶重，高水負荷狀態持續時間長有關(guan) 。30℃/min和10℃/min複溫，溫差大，細胞內(nei) 再結晶重。1℃/min複溫，雖然再結晶輕，但細胞內(nei) 高水負荷持續時間長，細胞損害亦重。4℃/min複溫方法較好地保持了細胞活性，可能與(yu) 熱交換時間充裕，再結晶輕，細胞內(nei) 高水負荷狀態未超臨(lin) 界值有關(guan) 。自增壓液氮罐