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分離豬胚胎多能幹細胞方法
時間:2018-05-21 11:06來源: 作者:秩名 點擊:
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胚胎幹細胞從囊胚內細胞團分離得到，具有自我更新和分化為3個胚層和生殖細胞的潛能。豬胚胎分離培養體係會改變細胞核移植胚胎、孤雌胚胎和體內胚胎多能基因的表達，也會影響豬多能幹細胞形成的效率和質量。自增壓液氮罐
細胞培養：用於核移植供體的豬胎兒成纖維細胞從初生豬仔的耳部分離得到。細胞培養基為DMEM，15%胎牛血清，培養溫度為37℃。使用0.25%（W/V）的胰蛋白酶消化，中和後離心200×g。將細胞重懸後並加入等量凍存液（40%DMEM，40%FBS和20%DMSO），貯存在液氮中。
卵母細胞的收集和準備：從屠宰場收集豬卵巢，保存在含有青/鏈黴素的生理鹽水中，運輸溫度32~38℃，3h內運回實驗室。采用抽吸法采集卵巢卵母細胞。抽取3~6mm卵泡中的卵母細胞置於15mL離心管中，37℃水浴靜置數分鍾，待卵母細胞沉降後，用洗卵液洗2遍，顯微鏡下挑取顆粒細胞層達3層以上的卵丘卵母細胞複合物，然後將COCs轉入U型皿中培養42~44h，每孔加500μL成熟培養液，每孔放置50~70枚。
孤雌激活和胚胎培養：用電融合儀將成熟的卵母細胞進行電激活，將卵母細胞移至2mmol/L6D孵育2.5h。分別將卵母細胞轉移到胚胎培養基G1、NCSU23和豬受精卵培養基，24h後記錄卵裂率。3d後，將培養基G1中發育的胚胎移入囊胚培養基G2。再次培養3~4d後，統計囊胚個數並收集。
體細胞核移植胚胎培養：去除成熟卵母細胞第一極體，隨後注入供體細胞。顯微操作後，移入含10%FBS的M199培養基，在38.5℃，5%CO2條件下孵育0.5h，使用電融合儀進行激活處理，移入6D孵育2.5h後，將重組胚胎在NCSU23培養基中培養3d，隨後替換NC-SU23繼續培養3~5d，觀察胚胎的發育。
體內胚胎的收集：從人工受精的母豬體內收集第7~8d的囊胚，所有方法參照Stokes等。每天監測母豬的發，將發日期作為0d，鑒定後的6、12和18h進行人工受精。從子宮衝洗胚胎時使用預熱的含10%FBS的磷酸緩衝鹽溶液。
從豬胚胎分離胚胎多能幹細胞：將去除透明帶的囊胚接種到絲裂 素C處理過的小鼠胚胎成纖維細胞飼養層上2~4d，囊胚內細胞團在3~5d後出現。待ICM大小適中時，用機械法分離細胞，重鋪到新的飼養層上，並使用不同的豬胚胎幹細胞培養基，胚胎多能幹細胞克隆每5~7d使用機械法傳代。自增壓液氮罐
細胞培養：用於核移植供體的豬胎兒成纖維細胞從初生豬仔的耳部分離得到。細胞培養基為DMEM，15%胎牛血清，培養溫度為37℃。使用0.25%（W/V）的胰蛋白酶消化，中和後離心200×g。將細胞重懸後並加入等量凍存液（40%DMEM，40%FBS和20%DMSO），貯存在液氮中。
卵母細胞的收集和準備：從屠宰場收集豬卵巢，保存在含有青/鏈黴素的生理鹽水中，運輸溫度32~38℃，3h內運回實驗室。采用抽吸法采集卵巢卵母細胞。抽取3~6mm卵泡中的卵母細胞置於15mL離心管中，37℃水浴靜置數分鍾，待卵母細胞沉降後，用洗卵液洗2遍，顯微鏡下挑取顆粒細胞層達3層以上的卵丘卵母細胞複合物，然後將COCs轉入U型皿中培養42~44h，每孔加500μL成熟培養液，每孔放置50~70枚。
孤雌激活和胚胎培養：用電融合儀將成熟的卵母細胞進行電激活，將卵母細胞移至2mmol/L6D孵育2.5h。分別將卵母細胞轉移到胚胎培養基G1、NCSU23和豬受精卵培養基，24h後記錄卵裂率。3d後，將培養基G1中發育的胚胎移入囊胚培養基G2。再次培養3~4d後，統計囊胚個數並收集。
體細胞核移植胚胎培養：去除成熟卵母細胞第一極體，隨後注入供體細胞。顯微操作後，移入含10%FBS的M199培養基，在38.5℃，5%CO2條件下孵育0.5h，使用電融合儀進行激活處理，移入6D孵育2.5h後，將重組胚胎在NCSU23培養基中培養3d，隨後替換NC-SU23繼續培養3~5d，觀察胚胎的發育。
體內胚胎的收集：從人工受精的母豬體內收集第7~8d的囊胚，所有方法參照Stokes等。每天監測母豬的發，將發日期作為0d，鑒定後的6、12和18h進行人工受精。從子宮衝洗胚胎時使用預熱的含10%FBS的磷酸緩衝鹽溶液。
從豬胚胎分離胚胎多能幹細胞：將去除透明帶的囊胚接種到絲裂 素C處理過的小鼠胚胎成纖維細胞飼養層上2~4d，囊胚內細胞團在3~5d後出現。待ICM大小適中時，用機械法分離細胞，重鋪到新的飼養層上，並使用不同的豬胚胎幹細胞培養基，胚胎多能幹細胞克隆每5~7d使用機械法傳代。自增壓液氮罐
